生姜含有多种生物活性成分

作为一种常见的酵对姜油香辛料，生姜含有多种生物活性成分，树脂包括不挥发且有刺激性气味的抗氧姜辣素，具有抗氧化、化活抑菌、影响散寒、酵对姜油活血等作用。树脂姜油树脂是抗氧经超临界CO₂萃取干姜而得到的半液态混合物，充分保留了生姜的化活活性成分与独特风味，是影响天然的香料与防腐剂。但由于其特有的酵对姜油辛辣刺激性气味，使产品不易被大众接受，树脂而且姜油树脂中生物活性更高、抗氧不良气味较弱的化活姜烯酚类等含量很少，既影响了功效发挥，影响也限制了市场应用。目前，对生姜活性的提升主要采用化学物理方法，效率低，成本高，副作用还多，而通过微生物发酵提高生姜生物活性方面的研究较少。

霉是传统发酵工业的优良菌种，可利用不同的原料在特定的条件下发酵和代谢生产人们所需的各种产物，如L-乳酸、L-苹果酸、富马酸和脂肪酶等，以及其他特异性酶及特殊代谢产物，在食药、环保等领域的应用也不断开拓。

本实验以乳化姜油树脂为底物进行根霉发酵，通过测定根霉生物量、培养物pH、抗氧化活性、发酵液成分等指标，分析根霉发酵对生姜活性物质抗氧化活性的影响，为高附加值生姜风味发酵食品的开发及天然生姜资源优势的利用提供理论基础。

一、材料与方法

1、材料与设备

根霉菌株:RhizopusoryzaeMG1、RhizopusoryzaeMG4、RhizopusoryzaeMG5（分离于清香大曲)，RhizopustonkinesisDMG(分离于东京根霉曲)，安琪根霉AMG(分离于安琪甜酒曲，安琪股份有限公司产品)，均保藏于山西师范大学生物工程实验室。

姜油树脂，青岛利和萃取股份有限公司产品；PDA培养基、琼脂粉，青岛海博生物技术有限公司产品，DPPH、ABTS，TPTZ、水溶性维生素E，北京伊诺凯科技有限公司品，乙酸乙酯、甲醇、乙酸、乙酸钠、浓盐酸、过硫酸钾、吐温-80，天津市科密欧化学试剂有限公司产品；FeCl₃·6H₃O，上海展云化工有限公司产品。以上试剂均为分析纯6-、8-、10-姜酚(6-G、8-G、10-G)以及6-、8-、10-姜烯酚(6-s、8-S、10-S)标准品，美国Chromadex公司，色谱甲醇，色谱乙腈，赛默飞世尔科技公司；超纯水，娃哈哈有限公司。

FA2204B型电子天平，上海精科产品；YXO-LS-50SI型高压蒸汽灭菌锅、SW-CJ-2FD型超净工作台，上海博讯产品:HPX-9272MBE型数显电热培养箱，上海一恒产品:SHA-C型水浴恒温振荡器，上海福玛实验设备有限公司产品:pH-3C型pH计，上海雷磁产品；5804R型高速冷冻离心机，德国基因有限公司产品；HH-6型数显恒温水浴锅，江苏金坛荣华仪器制造有限公司产品；752N型紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司产品；1260LC高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司产品。

2、实验方法

（1）菌种活化及孢子悬液制备

将保藏的根霉菌株接种于马铃薯葡萄糖(PDA)液体培养基，28℃震荡(150r/min)活化三天后转接于PDA斜面培养基上28℃培养4d，此时菌丝长满黑色的孢子，用无菌生理盐水洗涤斜面制备孢子悬液，稀释调节孢子悬液浓度约5x10⁵/mL，28℃震荡(150r/min)培养8h，促使孢子萌发，备用。

（2）姜油树脂预处理

取10mL吐温-80置于棕色瓶中，高压蒸汽灭菌后加入10mL姜油树脂，搅拌均匀，使姜油充分乳化，加入无菌水80mL，稀释10倍，搅拌均匀备用。以上步骤均需无菌操作。此状态下姜油树脂乳浊液体系均匀，在室温下静置或冷藏状态下均不会发生油水分层。后文添加量按乳浊液中姜油树脂的实际体积计算。

（3）发酵液预处理

在20mLPDA液体培养基中接种1%的孢子悬液，添加适量姜油树脂稀释液为底物，28℃震荡(150r/min)培养4d。将发酵液全部移入离心管，残渣用5mL蒸馏水洗涤后移入离心管，离心管中加入15mL乙酸乙酯，混合均匀后6000r/min离心20min，用医用注射器吸取乙酸乙酯上清液，氮吹干燥，甲醇定容至10mL，-20℃冰箱储存。以根霉发酵后，再添加姜油树脂为对照。

（4）根霉生物量的测定

姜油树脂添加到PDA液体培养基中与根霉共发酵，每8h取样测定培养物pH与菌丝湿重，绘制相应的pH曲线与生长量曲线。

（5）根霉发酵姜油树脂条件的单因素试验

在20mLPDA液体培养基中添加适量姜油树脂，接种1%的孢子悬液，选择姜油树脂添加量、发酵温度及发酵时间进行单因素试验。固定发酵温度35℃和发酵时间4d，研究分别添加10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL、120μL、140μL、160μL、180uL、200μL姜油树脂经发酵后的总抗氧化活性。固定姜油树脂添加量70μL与发酵时间4d，研究20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃下姜油树脂经发酵后的总抗氧化活性。固定姜油树脂添加量70μuL与培养温度35℃，研究经1～7d发酵后姜油树脂的总抗氧化活性。

（6）根霉发酵姜油树脂条件的响应面分析

以单因素试验为基础，选姜油树脂添加量、发酵温度与发酵时间为自变量，发酵后姜油树脂的总抗氧化活性为响应值，使用DesignExpertversion8.06(MinneapolisMN，USA)软件的BBD(Box-Behnkendesign)程序，进行响应面优化方案设计，其中的方差分析(analysisofvariance，ANOVA)程序用于实验数据分析和模型拟合，由模型计算最高抗氧化活性以及对应的不同因素的最佳水平。

（7）抗氧化活性评价

参考郭京波等的实验方法。测定发酵后姜油树脂的DPPH、ABTS自由基清除能力及Fe3+还原能力(FRAP)，计算3种抗氧化活性评价结果的总和，即总抗氧化活性(TAC)，单位为umolTE(水溶性维生素E)/gGingeroleoresin(姜油树脂)。

（8）姜油树脂活性成分高效液相色谱分析

发酵完成后，将锥形瓶放入真空干燥箱，将培养基蒸干后加入5mL甲醇，超声萃取5min，第二次与第三次各加入5mL超声辅助萃取5min，使培养基中的生姜活性物质充分溶入甲醇，合并萃取液以甲醇定容至20mL后-20℃储存，进行高效液相色谱分析时取适量用0.22μm的尼龙膜过滤后进样。

用甲醇配制0.2m/mL的6-、8-、10-姜酚以及6-、8-、10-姜烯酚标准品母液，-20℃冰箱储存。高效液相色谱操作条件:检测波长280nm，进样体积10uL；流速1.0mL/min；柱温48℃；运行时间62min；流动相A为乙腈，B为1%的冰醋酸。梯度洗脱条件为:0～10min，45%A；10～20min，65%A；20～40min，95%A；40～50min，100%A；50～62min，45%A。

二、结果与讨论

1、不同根霉菌株发酵姜油树脂培养物抗氧化活性的比较

为比较不同根霉菌株发酵姜油树脂的能力，选取实验室保藏的五株根霉进行发酵，即R.oryzaeMG1、R.oryzaeMG4.R.oryzaeMG5、R.tonkinesisDMG、AMG，在20mLPDA液体培养基中添加50μL姜油树脂，分别接种1%的孢子悬液，28℃震荡(150r/min)培养4d后，以DPPH法、ABTS法、FRAP法测定抗氧化活性，并计算TAC，结果如见图1。

如图1所示，经MG1、MG4、MG5、AMG、DMG发酵后，姜油树脂的TAC分别1890.51士5.38μmol/g，1543.38土5.35μmol/g，1494.53士3.98μmol/g，1784.97土8.I6μmol/g，1795.12土6.07μmolg。R.oryzaeMGI活性最高，发酵力强，且发酵液气味清香不刺激，姜油树脂辛辣的气味减弱，有淡淡的柠檬香味；MG4、MG5、AMG发酵液的姜油树脂辛辣气味还是比较明显；DMG发酵液则会产生令人不愉快的气味。因此后续实验选择R.oryzaeMG1进行发酵条件的优化。

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